مستخدم:آلاء زيتون/ملعب78
إعداد بلاسميد[عدل]
إعداد البلازميد هو طريقة لاستخراج الحمض النووي وتنقية للحمض النووي البلازميد. وقد تم تطوير العديد من الطرق لتنقية الحمض النووي البلازميد من البكتيريا. هذه الأساليب تنطوي دائما على ثلاث خطوات: [1]
نمو الثقافة البكتيرية
حصاد وتحلل من البكتيريا
تنقية الحمض النووي البلازميد
نمو الثقافة البكتيرية[عدل]
يتم تنقية البلازميدات دائمًا تقريبًا من ثقافات البكتيريا السائلة ، عادة ما تكون E. coli ، والتي تم تحويلها وعزلها. تقريبا جميع ناقلات البلازميد في الاستخدام المشترك ترميز واحد أو أكثر من الجينات مقاومة المضادات الحيوية كعلامة اختيار، على سبيل المثال المقاومة الأمبيسيلين ترميز الجينات أو الكاناميسين، والذي يسمح للبكتيريا التي تم تحويلها بنجاح لتكاثر غير المقيد. البكتيريا التي لم تأخذ ناقلات البلازميد يفترض أن تفتقر إلى جين المقاومة، وبالتالي من المتوقع فقط المستعمرات التي تمثل التحولات الناجحة أن تنمو. وتزرع البكتيريا في ظروف مواتية.
حصاد وتحلل من البكتيريا[عدل]
عندما يتم lysed البكتيريا تحت ظروف قلوية (درجة الحرارة 12.0-12.5) يتم تجزئة كل من الحمض النووي الصبغي والبروتين; ال "بلازميد" DNA ومع ذلك، لا تزال مستقرة. بعض العلماء تقليل تركيز اه تستخدم ل0.1M من أجل الحد من حدوث ssDNA. بعد إضافة الخلات التي تحتوي على تحييد العازلة كبيرة وأقل مفرط الالتفاف الصبغية الحمض النووي والبروتينات يترسب، ولكن البلازميدات الحمض النووي البكتيرية الصغيرة البقاء في الحل.
التحضيرات حسب الحجم[عدل]
مجموعات متوفرة من مختلف الشركات المصنعة لتنقية الحمض النووي للبلازميدة، والتي سميت بحجم الثقافة البكتيرية والغلة البلازمية المقابلة. في زيادة النظام ، وهذه هي miniprep ، midiprep ، تحضير أقصى، megaprep ، و gigaprep. سوف تختلف العائد الحمض النووي البلازميد اعتمادا على عدد نسخة البلازميد، والنوع والحجم، وسلالة بكتيرية، وظروف النمو، ومجموعة.
الإعداد المصغر[عدل]
Minipreparation من الحمض النووي البلازميد هو عزل سريع على نطاق صغير للحمض النووي البلازميد من البكتيريا. وهو يستند إلى طريقة التحلل القلوية. الحمض النووي البلازميد المستخرج الناتج عن تنفيذ miniprep هو نفسه في كثير من الأحيان يسمى "miniprep". وتستخدم Minipreps في عملية الاستنساخ الجزيئي لتحليل استنساخ البكتيريا. العائد الحمض النووي البلازمي نموذجي من miniprep هو 5 إلى 50 ميكروغرام اعتمادا على سلالة الخلية. Miniprep من عدد كبير من البلازميدات يمكن أيضا أن يتم مريح على ورقة مرشح عن طريق يحل الخلية واللتي على البلازميد على ورقة الترشيح.
الإعدادية Midi[عدل]
حجم ثقافة الإشريكية القولونية يبدأ هو 15-25 مل من مرق الليسوجيني (LB) والعائد المتوقع للحمض النووي هو 100-350 ميكروغرام.
ماكسي الإعدادية[عدل]
يبدأ حجم ثقافة الإشريكية القولونية E 100-200 مل من LB والعائد المتوقع للحمض النووي هو 500-850 ميكروغرام.
الإعداد الضخم[عدل]
يبدأ حجم ثقافة الإشريكية القولونية E 500 مل – 2.5 لتر من LB والعائد المتوقع للحمض النووي هو 1.5-2.5 ملغ.
جيجاتا الإعدادية[عدل]
يبدأ حجم ثقافة الإشريكية القولونية E. 2.5-5 L من LB والعائد المتوقع للحمض النووي هو 7.5-10 ملغ.
تنقية الحمض النووي البلازميد[عدل]
توجد طرق متعددة لتنقية الحمض النووي. تعمل جميعها على مبدأ توليد الظروف التي يترسب فيها حمض النووي فقط، أو الجزيئات الحيوية الأخرى فقط، مما يسمح بفصل الحمض النووي.
الإيثانول هطول الأمطار[عدل]
يعمل ترسيب الإيثانول باستخدام الإيثانول كمذيب للحمض النووي، مما يؤدي إلى الترسب خارج المحلول. يتم التخلص من الكسر القابل للذوبان لإزالة الجزيئات الحيوية الأخرى.
عمود الدوران[عدل]
يُعجل تنقية الحمض النووي القائم على العمود الدوار بحامض النوويات بحيث يربط مصفوفة صلبة ومكونات أخرى تتدفق من خلالها. ثم يتم تغيير الظروف إلى إلتويس الحمض النووي النقي.
استخراج الفينول- الكلوروفورم[عدل]
في استخراج الفينول والكلوروفورم، فإن إضافة خليط الفينول/الكلوروفورم سوف تذوب الملوثات البروتينية والدهون، وترك الأحماض النووية في المرحلة مائي. كما أنه يُشبه البروتينات، مثل DNase، وهو أمر مهم بشكل خاص إذا كان البلازميدات ستستخدم في هضم الإنزيم. خلاف ذلك، قد يحدث تشويه في شكل مقيد الانزيم من الحمض النووي plasmid.
مراجع[عدل]
بوشار، رولاند؛ وآخرون (2010). طرق المختبر في علم الأحياء الدقيقة. العالمية العلمية. ص. 119-126.
مزيد من القراءة[عدل]
بيرنبوم إتش سي، دولي جي (تشرين الثاني/نوفمبر 1979). "إجراء استخراج القلوية السريعة لفحص الحمض النووي plasmid المؤتلف". أبحاث الأحماض النووية. 7 (6): 1513–23. دوي: 10.1093/nar/7.6.1513. PMC 342324. PMID 388356.
الروابط الخارجية[عدل]
http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/Plasmid/Miniprep/
إجراء الإعدادية المصغرة باستخدام الأرض دياتوماوس لربط الحمض النووي أثناء تنقية وغسل.